Η χρωματογραφία υψηλής πίεσης ανήκει στις χρωματογραφικές τεχνικές, άρα ο διαχωρισμός είναι αποτέλεσμα της συνδυαστικής δράσης μιας στατικής και μιας κινητής φάσης. Στην HPLC, το δείγμα εισάγεται στη κορυφή της στήλης και με τη βοήθεια της κινητής φάσης, τα συστατικά του μετακινούνται με τη μορφή ζωνών και τελικά εκλούονται το ένα μετά το άλλο. Οι αναλυόμενες ουσίες κατανέμονται μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης, με αποτέλεσμα να μετακινούνται με διαφορετικές ταχύτητες κατά μήκος της στήλης.
Μηχανισμοί και είδη HPLC
Στην HPLC μπορούν να συμπεριληφθούν και να εφαρμοστούν όλα τα είδη που λαμβάνουν χώρα στους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς, με την κατάλληλη χρήση υλικού πληρώσεως της στήλης και του διαλύτη έκλουσης.
Χρωματογραφία Προσρόφησης.
Ο διαχωρισμός των διαφόρων ουσιών βασίζεται στο διαφορετικό βαθμό προσρόφησης στη στατική φάση. Οι κυριότερες αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι ηλεκτροστατικής φύσης. Η χρωματογραφία προσρόφησης βρίσκει εφαρμογή στο διαχωρισμό ουσιών με παρόμοια δομή, αλλά με διαφορετική πολικότητα.
Ανάλογα με τη σχέση πολικότητας μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης διακρίνονται δύο είδη χρωματογραφίας προσρόφησης:
Χρωματογραφία Κανονικής Φάσης
Εδώ, η στατική φάση (συνήθως SiO2 ή Al2O3) είναι πολικότερη από την κινητή, η οποία αποτελείται από μη πολικούς διαλύτες όπως εξάνιο, χλωροφόρμιο
Χρωματογραφία Αντίστροφης Φάσης
Εδώ, η στατική φάση, η οποία είναι λιγότερο πολική της κινητής, αποτελείται από οξείδιο πυριτίου συζευγμένο με διάφορες ομάδες όπως αλκύλια (ακετύλιο, δεκαοκτύλιο), φαινύλιο, διόλες, αμινομάδες, κυανομάδες κ.ά., ενώ η κινητή φάση αποτελείται από μείγματα οργανικών διαλυτών (μεθανόλη ,ακετονιτρίλιο, κ.ά.) με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα και νερό.
Χρωματογραφία Κατανομής
Ο διαχωρισμός στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μείγματος μεταξύ της κινητής και της υγρής στατικής φάσης και εφαρμόζεται στην ανάλυση ομόλογων, μη ιονικών ενώσεων.
Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής
Ο διαχωρισμός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυόμενων ιόντων και των φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης. Οι κυριότερες παράμετροι που καθορίζουν τη συγκράτηση στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής είναι το αντίθετο ιόν της δραστικής ομάδας της στατικής φάσης ,η ιονική ισχύς, το pΗ, ο τροποποιητής της κινητής φάσης και η θερμοκρασία.
Χρωματογραφία Συγγένειας
Για την επίτευξη του διαχωρισμού , οι προσδιοριζόμενες ενώσεις δεσμεύονται εκλεκτικά σε υποκαταστάτες, οι οποίοι είναι συνδεδεμένοι στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου. Στη κατηγορία αυτή ανήκει η Χρωματογραφία Εναντιομερών, η οποία αποκτά αυξανόμενο ενδιαφέρον και με την οποία διαχωρίζονται εναντιομερείς μορφές ενώσεων που παρουσιάζουν χειρομορφία
Χρωματογραφία Αποκλεισμού Μεγέθους ή Διάχυσης Πηκτής
Ο διαχωρισμός γίνεται με βάση το σχήμα και το μέγεθος των μορίων των αναλυόμενων ενώσεων και βρίσκει εφαρμογές στην ανάλυση και το χαρακτηρισμό των πολυμερών.
Τα μεγάλα μόρια εξέρχονται πρώτα από τη στήλη, ενώ τα μικρά μόρια, καθώς εισέρχονται στους πόρους των σωματιδίων της στατικής φάσης, καθυστερούν και βγαίνουν αργότερα.
Οργανολογία Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης
Ένα σύστημα HPLC περιλαμβάνει:
-Φιάλες αποθήκευσης διαλυτών
-Αντλία (σταθερής ροής ,σταθερής πίεσης)
-Μονάδα εισαγωγής δείγματος (βαλβίδα εισαγωγής δείγματος, αυτόματος δειγματολήπτης)
-Χρωματογραφική στήλη
-Ανιχνευτή
-Καταγραφικό
Στην αναλυτική στήλη γίνεται ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος, ενώ η προώθηση της κινητής φάσης διαμέσου της στήλης γίνεται με την αντλία. Η διεργασία του χρωματογραφικού διαχωρισμού αρχίζει με την εισαγωγή του δείγματος στη στήλη.
Ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται στην HPLC
Οι ανιχνευτές που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην HPLC είναι οι παρακάτω:
- Ανιχνευτές ορατού-υπεριώδους
- Παράταξης φωτοδιόδων
-Αγωγιμομετρικοί
-Δείκτου διάθλασης
-Φασματογράφοι μάζας
-Ηλεκτροχημικοί
-Φθορισμομετρικοί
-Ραδιενέργειας
-Σκεδασμού φωτός
-Φλόγας (ιονισμού φλόγας, εκπομπής, φωτομετρικοί ανιχνευτές)
Ανιχνευτές Ορατού-Υπεριώδους
Η απορρόφηση ακτινοβολίας από μια χημική ένωση εξαρτάται από το μήκος κύματος της ακτινοβολίας και τις ομάδες της χημικής ένωσης. Το ηλεκτρομαγνητικό πεδίο, ανάλογα με την ενέργεια (συχνότητα) που αλληλεπιδρά με τα ηλεκτρόνια, προκαλεί τη διέγερση και μεταφορά τους σε υψηλότερα ενεργειακά επίπεδα, ή ακόμα προκαλεί δόνηση ή περιστροφή μοριακών δεσμών ορισμένων ομάδων της ένωσης.
Το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα χωρίζεται στις περιοχές:
Υπερύθρου (IR) 2500-50000 nm
Έγγυς IR 800-2500 nm
Ορατό Vis 400-800 nm (λάμπα W)
Υπεριώδους UV 190-400 nm (λάμπα D2 ή Hg)
Σύμφωνα με το νόμο του Lambert-Beer, η απορρόφηση της ακτινοβολίας (A) είναι ανάλογη της συγκέντρωσης (C) της ένωσης στη κυψελίδα και του της κυψελίδα (d) A= εCd, όπου (ε) ο μοριακός συντελεστής απορρόφησης
Η απορρόφηση ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας στην περιοχή UV-Vis αντιστοιχεί στη διέγερση χαμηλών ενεργειακά ηλεκτρονίων όπως π ηλεκτρόνια ή μη συζευγμένα ηλεκτρόνια ορισμένων ομάδων.
Επιλογή Κινητής Φάσης
Είναι γνωστό από τη χρωματογραφική θεωρία ότι η διαχωριστική ικανότητα Rs εξαρτάται από τον αριθμό των θεωρητικών πλακών Ν, τον παράγοντα συγκράτησης k΄ και τον παράγοντα διαχωρισμού. Η βελτιστοποίηση των παραμέτρων k΄ και α γίνεται κυρίως με αλλαγές στη σύσταση της κινητής φάσης . Έτσι, μετά την επιλογή της στατικής φάσης (βελτιστοποίηση του Ν), η οποία πρέπει να έχει παρόμοια πολικότητα με τις προσδιοριζόμενες ενώσεις, επιλέγεται η κινητή φάση έτσι ώστε k'(1,10).
Επιλογή Στατικής Φάσης
Η επιλογή της στατικής φάσης και της κατάλληλης αναλυτικής στήλης είναι σημαντικά για την ανάπτυξη μιας αναλυτικής μεθόδου και καθορίζεται από τις επιμέρους παραμέτρους:
i. Το μέγεθος των μορίων του υλικού πληρώσεως και τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά της στήλης
ii. Η φύση της ομάδας που είναι δεσμευμένη στο υπόστρωμα, η οποία καθορίζει και την εκλεκτικότητα της στατικής φάσης
iii. Η διάμετρος των πόρων του υλικού πληρώσεως
iv. Ο τύπος του υποστρώματος το οποίο πρέπει να είναι χημικά αδρανές.
v. Η περιεκτικότητα της στήλης σε ελεύθερα σιλανολικά υδροξύλια. Όσο μεγαλύτερο είναι το ποσοστό τους , τόσο πιο πολική (όξινη) είναι η στήλη και τόσο ασθενέστερη είναι η συγκράτηση των μη πολικών ενώσεων.
Βιβλιογραφία
Ενόργανη Χημική Ανάλυση, Ι. Παπαδογιάννης, Β. Σαμανίδου, Θεσσαλονίκη (2000)
Ποσοτική Χημική Ανάλυση, Ι.Α Στράτης, Α.Ν Βουλγαρόπουλος, Ι.Α. Ζαχαριάδης, Θεσσαλονικη 1999
Μηχανισμοί και είδη HPLC
Στην HPLC μπορούν να συμπεριληφθούν και να εφαρμοστούν όλα τα είδη που λαμβάνουν χώρα στους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς, με την κατάλληλη χρήση υλικού πληρώσεως της στήλης και του διαλύτη έκλουσης.
Χρωματογραφία Προσρόφησης.
Ο διαχωρισμός των διαφόρων ουσιών βασίζεται στο διαφορετικό βαθμό προσρόφησης στη στατική φάση. Οι κυριότερες αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι ηλεκτροστατικής φύσης. Η χρωματογραφία προσρόφησης βρίσκει εφαρμογή στο διαχωρισμό ουσιών με παρόμοια δομή, αλλά με διαφορετική πολικότητα.
Ανάλογα με τη σχέση πολικότητας μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης διακρίνονται δύο είδη χρωματογραφίας προσρόφησης:
Χρωματογραφία Κανονικής Φάσης
Εδώ, η στατική φάση (συνήθως SiO2 ή Al2O3) είναι πολικότερη από την κινητή, η οποία αποτελείται από μη πολικούς διαλύτες όπως εξάνιο, χλωροφόρμιο
Χρωματογραφία Αντίστροφης Φάσης
Εδώ, η στατική φάση, η οποία είναι λιγότερο πολική της κινητής, αποτελείται από οξείδιο πυριτίου συζευγμένο με διάφορες ομάδες όπως αλκύλια (ακετύλιο, δεκαοκτύλιο), φαινύλιο, διόλες, αμινομάδες, κυανομάδες κ.ά., ενώ η κινητή φάση αποτελείται από μείγματα οργανικών διαλυτών (μεθανόλη ,ακετονιτρίλιο, κ.ά.) με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα και νερό.
Χρωματογραφία Κατανομής
Ο διαχωρισμός στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μείγματος μεταξύ της κινητής και της υγρής στατικής φάσης και εφαρμόζεται στην ανάλυση ομόλογων, μη ιονικών ενώσεων.
Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής
Ο διαχωρισμός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυόμενων ιόντων και των φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης. Οι κυριότερες παράμετροι που καθορίζουν τη συγκράτηση στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής είναι το αντίθετο ιόν της δραστικής ομάδας της στατικής φάσης ,η ιονική ισχύς, το pΗ, ο τροποποιητής της κινητής φάσης και η θερμοκρασία.
Χρωματογραφία Συγγένειας
Για την επίτευξη του διαχωρισμού , οι προσδιοριζόμενες ενώσεις δεσμεύονται εκλεκτικά σε υποκαταστάτες, οι οποίοι είναι συνδεδεμένοι στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου. Στη κατηγορία αυτή ανήκει η Χρωματογραφία Εναντιομερών, η οποία αποκτά αυξανόμενο ενδιαφέρον και με την οποία διαχωρίζονται εναντιομερείς μορφές ενώσεων που παρουσιάζουν χειρομορφία
Χρωματογραφία Αποκλεισμού Μεγέθους ή Διάχυσης Πηκτής
Ο διαχωρισμός γίνεται με βάση το σχήμα και το μέγεθος των μορίων των αναλυόμενων ενώσεων και βρίσκει εφαρμογές στην ανάλυση και το χαρακτηρισμό των πολυμερών.
Τα μεγάλα μόρια εξέρχονται πρώτα από τη στήλη, ενώ τα μικρά μόρια, καθώς εισέρχονται στους πόρους των σωματιδίων της στατικής φάσης, καθυστερούν και βγαίνουν αργότερα.
Οργανολογία Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης
Ένα σύστημα HPLC περιλαμβάνει:
-Φιάλες αποθήκευσης διαλυτών
-Αντλία (σταθερής ροής ,σταθερής πίεσης)
-Μονάδα εισαγωγής δείγματος (βαλβίδα εισαγωγής δείγματος, αυτόματος δειγματολήπτης)
-Χρωματογραφική στήλη
-Ανιχνευτή
-Καταγραφικό
Στην αναλυτική στήλη γίνεται ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος, ενώ η προώθηση της κινητής φάσης διαμέσου της στήλης γίνεται με την αντλία. Η διεργασία του χρωματογραφικού διαχωρισμού αρχίζει με την εισαγωγή του δείγματος στη στήλη.
Ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται στην HPLC
Οι ανιχνευτές που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην HPLC είναι οι παρακάτω:
- Ανιχνευτές ορατού-υπεριώδους
- Παράταξης φωτοδιόδων
-Αγωγιμομετρικοί
-Δείκτου διάθλασης
-Φασματογράφοι μάζας
-Ηλεκτροχημικοί
-Φθορισμομετρικοί
-Ραδιενέργειας
-Σκεδασμού φωτός
-Φλόγας (ιονισμού φλόγας, εκπομπής, φωτομετρικοί ανιχνευτές)
Ανιχνευτές Ορατού-Υπεριώδους
Η απορρόφηση ακτινοβολίας από μια χημική ένωση εξαρτάται από το μήκος κύματος της ακτινοβολίας και τις ομάδες της χημικής ένωσης. Το ηλεκτρομαγνητικό πεδίο, ανάλογα με την ενέργεια (συχνότητα) που αλληλεπιδρά με τα ηλεκτρόνια, προκαλεί τη διέγερση και μεταφορά τους σε υψηλότερα ενεργειακά επίπεδα, ή ακόμα προκαλεί δόνηση ή περιστροφή μοριακών δεσμών ορισμένων ομάδων της ένωσης.
Το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα χωρίζεται στις περιοχές:
Υπερύθρου (IR) 2500-50000 nm
Έγγυς IR 800-2500 nm
Ορατό Vis 400-800 nm (λάμπα W)
Υπεριώδους UV 190-400 nm (λάμπα D2 ή Hg)
Σύμφωνα με το νόμο του Lambert-Beer, η απορρόφηση της ακτινοβολίας (A) είναι ανάλογη της συγκέντρωσης (C) της ένωσης στη κυψελίδα και του της κυψελίδα (d) A= εCd, όπου (ε) ο μοριακός συντελεστής απορρόφησης
Η απορρόφηση ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας στην περιοχή UV-Vis αντιστοιχεί στη διέγερση χαμηλών ενεργειακά ηλεκτρονίων όπως π ηλεκτρόνια ή μη συζευγμένα ηλεκτρόνια ορισμένων ομάδων.
Επιλογή Κινητής Φάσης
Είναι γνωστό από τη χρωματογραφική θεωρία ότι η διαχωριστική ικανότητα Rs εξαρτάται από τον αριθμό των θεωρητικών πλακών Ν, τον παράγοντα συγκράτησης k΄ και τον παράγοντα διαχωρισμού. Η βελτιστοποίηση των παραμέτρων k΄ και α γίνεται κυρίως με αλλαγές στη σύσταση της κινητής φάσης . Έτσι, μετά την επιλογή της στατικής φάσης (βελτιστοποίηση του Ν), η οποία πρέπει να έχει παρόμοια πολικότητα με τις προσδιοριζόμενες ενώσεις, επιλέγεται η κινητή φάση έτσι ώστε k'(1,10).
Επιλογή Στατικής Φάσης
Η επιλογή της στατικής φάσης και της κατάλληλης αναλυτικής στήλης είναι σημαντικά για την ανάπτυξη μιας αναλυτικής μεθόδου και καθορίζεται από τις επιμέρους παραμέτρους:
i. Το μέγεθος των μορίων του υλικού πληρώσεως και τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά της στήλης
ii. Η φύση της ομάδας που είναι δεσμευμένη στο υπόστρωμα, η οποία καθορίζει και την εκλεκτικότητα της στατικής φάσης
iii. Η διάμετρος των πόρων του υλικού πληρώσεως
iv. Ο τύπος του υποστρώματος το οποίο πρέπει να είναι χημικά αδρανές.
v. Η περιεκτικότητα της στήλης σε ελεύθερα σιλανολικά υδροξύλια. Όσο μεγαλύτερο είναι το ποσοστό τους , τόσο πιο πολική (όξινη) είναι η στήλη και τόσο ασθενέστερη είναι η συγκράτηση των μη πολικών ενώσεων.
Βιβλιογραφία
Ενόργανη Χημική Ανάλυση, Ι. Παπαδογιάννης, Β. Σαμανίδου, Θεσσαλονίκη (2000)
Ποσοτική Χημική Ανάλυση, Ι.Α Στράτης, Α.Ν Βουλγαρόπουλος, Ι.Α. Ζαχαριάδης, Θεσσαλονικη 1999